由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是一种重要病害,赤霉病不仅造成作物产量损失,而且产生的真菌毒素严重威胁人畜健康。最近，CRISPR/Cas9基因组编辑系统已被用于精确敲除作物中的易感基因(S-genes)基因，产生抗性突变体;然而，它需要通过基因枪法或农杆菌介导法将CRISPR/Cas9和gRNA转化到植物中去。由于大多数小麦基因型的愈伤组织诱导和再生效率极低，这限制了基因编辑技术在小麦育种中的应用。因此，一种绕过组织培养的新型gRNA传递系统对于基因编辑在小麦育种中的成功应用至关重要。年3月29日，来自美国堪萨斯州立大学的GuihuaBai团队在知名期刊《PlantBiotechnologyJournal》上在线发表了一篇题为“DevelopmentandoptimizationofaBarleystripemosaicvirus(BSMV)-mediatedgeneeditingsystemtoimproveFusariumheadblight(FHB)resistanceinwheat”的文章，该文章介绍了大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的gRNA传递系统在小麦中的应用，并创造抗小麦赤霉病的遗传材料。该团队在之前的研究中克隆了编码富组氨酸钙结合蛋白Fhb1(TaHRC)，并证明了TaHRC起始密码子附近的大量缺失增加了小麦赤霉病的抗性。作者构建了小麦白化病基因phytoenedesaturase(TaPDS)和小麦赤霉病抗性基因TaHRC的sgRNAs，然后用含有同等浓度的BSMVα、β和γ::TaPDS或BSMVα、β和γ::TaHRC载体的农杆菌混合培养物，对4周大的本氏烟叶片进行农杆菌侵染。接种后6天，用RT-PCR检测接种的烟草叶片是否存在gRNA片段，然后用该汁液接种二叶期的Cas9过表达的小麦植株(图1b)。在21天后，使用T7核酸内切酶I(T7E1)突变检测方法评估了系统感染小麦叶片中TaPDS(58%)和TaHRC(49%)的突变效率(indel%)，并通过Sanger测序进一步证实(图1c-d)。为评价该系统用于多重基因编辑的可行性，将含有BSMVγ::TaPDS和BSMVγ::TaHRC载体的农杆菌混合培养物共侵染到烟草叶片中，然后用感染液接种上述制备的Cas9过表达材料。尽管多重基因编辑系统的突变效率(TaPDS为41%，TaHRC为47%)略低于单基因编辑系统(图1c,d,e)，但该系统有效传递了gRNA，并对小麦靶基因进行了精确编辑(图1c,d,e)。为了确定编辑的序列是否可遗传，作者筛选了株TaPDS的M1植物的和株TaHRC的M1植物，并确定了一个TaPDS白化突变体和两个TaHRC突变体(图1f)。为了提高编辑过的突变体的恢复率，作者采用浸花法（floral-dipagroinfiltrationmethod）在Cas9过表达材料开花前处理其穗部，得到了两个突变体，发现在TaHRC位点分别插入了57个核苷酸和3个核苷酸(图1c,e)，对这些突变体进行接种并进行小麦赤霉病抗性表型分析。在14天后，突变体穗上的症状小穗(PSS)比例显著低于非编辑对照(图1h-i)，这表明大麦条纹花叶病毒介导的基因编辑是可遗传的，敲除TaHRC等位基因可提高小麦赤霉病抗性。为了扩大这个编辑系统的实用性，在遗传转化效率较低的小麦品种中也做了实验，结果表明小麦赤霉病的表型显示突变体穗上的症状小穗(PSS)显著低于未编辑的对照(图1k-1)，证实TaHRC功能突变的缺失增加了小麦的赤霉病抗性。作者还发现添加mTaFT和tRNAIleumobilesequence可以提高可遗传编辑效率（从0.8%提高到2.3%和3.0%），证明了在病毒载体中添加RNA移动元件增加了编辑基因的可遗传序列突变和小麦突变体的恢复率，这与Ellison等人的观点一致，但与Li等人的观点不一致。作者最后推测可能是由于与sgRNA融合的RNA移动元件长度或类型的不同可能是造成这种差异的原因。综上所述，该团队开发并优化了大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的gRNA传递系统，编辑TaHRC基因，该系统具有在常规小麦育种中应用的潜力，可以在不受基因型限制的情况下提高小麦赤霉病的抗性。

原文链接：

转载请注明:http://www.xueguos.com/dmjs/23792.html